БІОТЕХНОЛОГІЯ ОТРИМАННЯ РЕКОМБІНАНТНОГО БІЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКУ (HSP-60) CHLAMYDIA TRACHOMATIS ТА ОЦІНКА ПЕРСПЕКТИВ ЙОГО ВИКОРИСТАННЯ У СЕРОЛОГІЧНІЙ ДІАГНОСТИЦІ
Анотація
Виявлення гуморальної імунної відповіді на білок теплового шоку масою 60 кДа Chlamydia trachomatis (HSP-60) має велике діагностичне значення, адже свідчить про ймовірний аутоімунний процес та ризик патології репродуктивної системи у жінок. Для розробки високоінформативного імуноферментного набору для виявлення анти-HSP-60 антитіл необхідно мати у розпорядженні відповідні біологічні компоненти, передусім очищений білок HSP-60. Найбільш сучасним є отримання білків-антигенів за допомогою методів генної інженерії та молекулярної біотехнології, що забезпечує не тільки стандартизацію отримуваного білка, але й дає можливість розробляти прогресивні технології виділення та очищення останнього. Проведено науково-методичну розробку біотехнології отримання рекомбінантного HSP-60 (rHSP-60) із накопиченням останнього у цитоплазмі клітин E. coli у розчинному вигляді: встановлені оптимальні параметри культивування продуценту (поживне середовище, температура, концентрація індуктора експресії та тривалість біосинтезу) забезпечують переважне (79%) накопичення цільового білка у розчинній формі. Технологія очистки rHSP-60 базується на використанні афінної хроматографії на глутатіон-сефарозі та ферментативного гідролізу GST-вмісного білку із використанням фактора згортання крові Ха, а також гель-фільтрації на Sephadex G-75 для доочищення. Для оцінки перспектив використання отриманого rHSP-60 нами були проведені порівняльні дослідження активності отриманого HSP-60 Ch. trachomatis як частини імуносорбенту у ІФА для виявлення відповідних специфічних антитіл класу IgG у сироватках крові людини. У якості антигенів для іммобілізації у лунках планшету використовували: власно отримані rHSP-60 та його білковий кон’югат rHSP-60-GST, комерційний аналог та GST. Додатково проводили оцінку імунологічної активності фракції мінорних білків, що містилися у елюаті після афінної хроматографії на глутатіон-сефарозі. Результати експериментів для групи позитивних сироваток оцінювали за індексом позитивності – співвідношенням середнього арифметичного значення оптичної густини у ІФА для позитивних та негативних (cut off) сироваток. Для отриманого rHSP-60 було отримано індекс позитивності на 30% вищій у порівняння із аналогічним комерційним протеїном. Порівняння імунологічної активності отриманого rHSP-60 та його кон’югату із GST засвідчили, що індекси позитивності при використанні двох даних білків у складі імуносорбенту були зіставними – 2,2 та 2,4, відповідно. Було доведено, що отримані нами препарати rHSP-60, а також його GST-кон’югату є високоактивними при їх використанні у складі імуносорбенту у імуноферментному аналізі для виявлення специфічних IgG-антитіл.
Ключові слова: білок теплового шоку, Chlamydia trachomatis, рекомбінантний білок, біосинтез, хроматографічна очистка.
Посилання
Исаков В.А., Куляшова Л.Б., Березина Л.А., Нуралова И.В., Гончаров С.Б., Ермоленко Д.К. Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза: Руководство для врачей. Под редакцией А. Б. Жебруна. СПб.: Тактик-Студио; 2010.
Мавров Г.И., Щербакова Ю.В., Чинов Г.П. Лечение осложненного урогенитального хламидиоза с применением азитромицина («Сумамед») в сочетании с патогенетической терапией. Венерологія. 2010; 3: 123-127.
Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Сыдыкнаби Ы. и др. Диагностические свойства синтезированного в Еscherichia coli рекомбинантного антигена gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота. Биотехнология. Теория и практика. 2012; 2: 1-10.
Рахматулина М.Р., Попов Д.В., Плахова К.И. Современные представления об эпидемиологии, клинике, диагностике и терапии неосложненных и осложненных форм урогенитальной хламидийной инфекции у мужчин. Вестник дерматологии и венерологии. 2012; 6: 35-41.
Славченко И.Ю., Шмидт В.А., Черных С.И., Кордюм В.А. Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации. Біополімери і клітина. 2003; 19(1): 81-88.
Чінов Г.П. Поширеність і клінічна характеристика хламідіозу й трихомоніазу – двох найчастіших статевих інфекцій. Венерологія. 2005; 1: 74-81.
Gardella T.J., Rubin D., Abou-Samra A.B., Keutmann H.T. et al. Expression of human parathyroid hormone-(1-84) in Escherichia coli as a factor X-cleavable fusion protein. J. Biol. Chem. 1990; 265(26): 15854-15859.
Ludeman J.P., Pike R.N., Bromfield K.M., Duggan P.J. et al. Determination of the P1′, P2′ and P3′ subsite-specificity of factor Xa. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2003; 35(2): 221-225.
Nagai K., Thogersen H.C. Synthesis and sequence-specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. Methods Enzymol. 1987; 153: 461-481.
Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1-100 kDalton. Anal. Biochem. 1987; 166: 368-379.
